T.P. Nro. 2 - Bacterias

Lo más importante del práctico

En este práctico, los principales objetivos son la comprensión de la importancia de un protocolo de laboratorio, el aprendizaje de un método de tinción diferencial y su concepto y el aprendizaje de las diferencias entre organismos procariontes y eucariontes. También es interesante la breve introducción que se da a la clasificación morfológica de las bacterias así como a la clasificación de los organismos en Reinos, que si bien en la actualidad tiende a cambiarse por la nueva clasificación evolutiva en Dominios, aún es válida y su uso es masivo. Introduciéndonos en el tema bacterias diremos que éstas, junto a las cianofitas (mal llamadas Algas Azul-verdosas, ya que en realidad no son algas...) comprenden el Reino Monera y como tal, son organismos procariontes unicelulares. Los otros reinos tienen un nivel creciente de complejidad. El Reino Protozoa está compuesto por organismos eucariontes unicelulares y el Fungi por eucariontes uni y pluricelulares mientras que los Reinos Animalia y Vegetalia comprenden únicamente organismos pluricelulares y eucariontes. Es fácil deducir qué es un organismo unicelular y uno pluricelular pero ¿qué significa que los organismos sean procariontes o eucariontes? Principales diferencias entre organismos procariontes y eucariontes:
Eucariontes Sólo los organismos del reino Vegetalia poseen Pared Celular y es de celulosa Poseen núcleo definido y Carioteca  Poseen organelas  Su ADN esta asociado a proteínas (histonas) conformando cromátidas.  Su ADN es lineal  Poseen múltiples moléculas de ADN	Procariontes  Poseen Pared Celular de péptido glicano y lipopolisacáridos No poseen Carioteca (núcleo disperso) No poseen organelas Su ADN se encuentra "desnudo" (no asociado a proteínas) Su ADN es circular Poseen 1 o 2 moléculas de ADN
Algunas Bacterias tienen la capacidad de formar esporas. Este es un sistema que les permite sobrevivir cuando las condiciones del medio no son favorables. Cuando por algún motivo (cambios de pH, de temperatura, etc.) el ambiente se torna adverso, la bacteria se deshidrata y se contrae secretando una nueva pared impermeable que la recubre. A diferencia de la célula vegetativa (vegetativa = en actividad), la espora no realiza ninguna actividad metabólica fuera de las estrictamente necesarias para sobrevivir. A causa de su pared impermeable, la espora no puede teñirse y al microscopio se puede identificar (con un ojo bastante experimentado) por el leve brillo que emite. ¿Por qué clasificar y cómo? Para clasificar cualquier grupo de elementos, debemos tomar una característica de referencia; por dar un ejemplo, diremos que para clasificar humanos puedo tomar como referencia el sexo y separarlos en Hombres y Mujeres, o bien puedo tomar como referencia el color de pelo y separarlos en Rubios, Morochos, Castaños y Pelirrojos (entre otros), pero el hecho de que en una clasificación respondan a una característica, no implica que deban pertenecer a un grupo determinado si la referencia es otra, vale decir que por el hecho de encontrar un Hombre Rubio no puedo decir que todos los Hombres serán Rubios ni que todos los Rubios serán Hombres. Lo mismo se aplica a las bacterias. Las bacterias...¿cómo clasificarlas? En el práctico se explicarán dos tipos distintos de clasificación, la morfológica que se basa en la forma externa de cada bacteria, y la tinción diferencial de Gram (cuya referencia es el tipo de Pared Celular). En el primer caso los grupos serán: Cocos, de forma redondeada y que agrupados darán Diplococos (de a dos), Estreptococos (de a varios en linea) y Estafilococos (de a varios en racimo); Bacilos, con forma de bastón y que pueden agruparse en línea y Espiraladas, con forma de tirabuzón y que serán Espirilos cuando tengan pocas vueltas y Espiroquetas cuando tengan muchas. Es un error muy frecuente creer que los Diplococos o los Estreptococos o cualquier grupo de bacterias son unidades funcionales. Un Estafilococo es una agrupación de bacterias, pero cada una de ellas actúa completamente por separado de sus compañeras. Si yo separo las bacterias que conforman un Diplococo, ambas seguirán su vida independientemente de la suerte de su compañera. No pasa lo mismo con un individuo (definido anteriormente como unidad funcional) en el cual las células interactúan entre sí. Por ejemplo, si a un perro decido separarle la cabeza del cuerpo, difícilmente estos fragmentos puedan continuar su vida por separado. La segunda clasificación se basa en la Tinción Diferencial de Gram que toma como referencia el tipo de pared celular de cada bacteria. Dependiendo de ello podrán ser Gram + (pared celular gruesa de péptido glicano) o Gram - (pared celular fina de péptido glicano). Al tener mayor grosor (y, por ende, masa) de péptido glicano, las Gram + tienen los poros más pequeños debido a la resistencia mecánica (fuerza) que ejerce la Pared Celular sobre los poros. Es fácil imaginarlo. Pensemos en dos piletas de lona que se hallan separadas por unos 50 cm. Mientras están vacías, la lona de las paredes cae recta y la distancia entre una y otra se mantiene, ahora bien, cuanto más agua echamos en ellas, mayor es la fuerza que este líquido ejerce sobre las paredes y estas comienzan a curvarse hacia fuera reduciendo el espacio entre ambas piletas. Básicamente lo mismo ocurre con los poros en las bacterias. Los pasos de la tinción se describen a continuación: Tinción Diferencial de Gram, procedimiento: Desengrasar el porta objeto lavándolo y pasándole un algodón con acetona. Es imprescindible eliminar restos de suciedad y grasas en el porta, de lo contrario el preparado no se podrá fijar correctamente. Colocar una gota de agua sobre el porta. El agua no es para hidratar el preparado (como en el TP 1) sino para disolver un poco el yogurt y lograr que se esparza bien por todo el porta. Flamear el ansa, tomar la muestra y expandirla sobre el porta, luego volver a flamear el ansa. Flamear significa poner sobre el mechero hasta que se ponga incandescente, con esto evitamos que cualquier sustancia infecte nuestra muestra y luego, que nuestra muestra permanezca en el ansa (si es yogurt no es grave, pero si uno trabaja con bacterias patógenas es mejor que no queden desperdigadas por ahí) Secar el preparado sobre el mechero. Esto es "fijar" el preparado, la idea es eliminar toda el agua que halla y que el preparado quede "pegado" al porta. Cubrir con Violeta de Genciana por 5´. Es indispensable cumplir con los tiempos, de otro modo los colorantes no llegan a introducirse correctamente en las células, no olvidemos que debe entrar por los poros de la misma. El Violeta de Genciana es soluble en H2O y entra en todas las bacterias tiñéndolas de violeta. Volcar el exceso. Siempre que colocamos un colorante o mordiente es recomendable deshacerse de los excesos de líquido ya que pueden interferir cuando apliquemos otra sustancia. Cubrir con lugol durante 3´. El Lugol actúa como "mordiente", vale decir, cristaliza al Violeta de Genciana formando un complejo insoluble en H2O pero soluble en alcohol-acetona. Decolorar con alcohol-acetona gota a gota. Este paso es fundamental porque en el reside la respuesta diferencial de las Gram + y las Gram -. Sabemos que la acetona deshidrata y contrae las células por contacto. Sabemos también que los poros de las Gram + son mas pequeños que los de las Gram -. Entonces, la solución alcohol-acetona, contrae los poros de las bacterias cerrando completamente los de las Gram + y parcialmente los de las Gram -. El resultado es que dicha solución ingresa en estas últimas decolorándolas. Hasta aquí tenemos las Gram + violetas y cerradas y las Gram - incoloras y abiertas. Cubrir con Fucsina Básica durante 5´. La Fucsina básica es parcialmente soluble en H2O e ingresará sólo en las Gram - ya que las otras continúan cerradas por efecto del alcohol-acetona. La Fucsina Básica interactúa con la membrana celular y forma un complejo insoluble en H2O. Eliminar el exceso y lavar con H2O para eliminar restos de colorante. Si bien los colorantes ahora son insolubles en agua (recordemos que el Violeta de Genciana fue “fijado” con lugol), el agua actúa lavando el exceso de arriba del portaobjetos por arrastre. La explicación más simple de esto es usando la analogía de la mancha de aceite en la vereda: si quisiéramos limpiarla usando agua vamos a notar que es imposible disolver el aceite... pero si uso una manguera a presión puedo “empujar” la mancha a otro sector. ¡Esto es lo que hacemos en el TP: empujamos el exceso de colorante fuera del portaobjetos, para poder ver lo que hay debajo! Observar al M.O.

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